Identificación de sustratos proteicos en celulas humanas para proteínas ROP cinasas de Toxoplasma gondii

Abstract

Summary Background: Toxoplasma secretes proteins known as ROP kinases; (ROPs) which are important for establishing the survival and growth of the parasite within the host cell. It has been shown that the Toxoplasma ROP5/ROP18 complex is the major effector related to virulence in mice. This complex specifically phosphorylates interferon-induced GTPases (IRGs). There is no evidence whether this complex or other ROP kinases are involved in the development of human toxoplasmosis. Aim: To search human substrates for Toxoplasma gondii ROP11, ROP39 ROP5 and ROP18 in a human cell line. Methodology 1a: We designed an algorithm called MSCA (Multiple Spectral Comparison Alignment) for the search of interactions between proteins (Toxoplasma and Human). 2a: recombinant proteins ROP11, ROP39, and GBP5 were cloned into pGEX4T1 and expressed in E. coli ROSSETTA DE3; with these proteins we performed Pull-down assays either with mass spectrometry (MS) or Western blot (WB). 2b: yeast 2 hybrids (Y2H) protein-protein interaction screening was performed between some ROPs and human GBPs 1-5. 2c: pro-IL1β levels were compared in human PBMCs infected ex-vivo with Toxoplasmas RH or RHΔROP18. Results 1a: MSCA proposed the interactions ROP11-SLC3A2, ROP11-ANXA6, ROP39-SHMT2, ROP39-ROP5, hGBP5-ROP5, and hGBP5-ROP18. 2a the interactions ROP11-SLC3A2, ROP11-ANXA6, ROP39-SHMT2, and ROP39-ROP5 were confirmed by Pull-down MS. 2b: the interactions hGBP5-ROP18 and hGBP5-ROP5 were observed in the yeast 2 hibrid (Y2H) screening interaction. The interactions ROP39-ROP5 and hGBP5-ROP5 were confirmed by Pull-down-WB. 2c: we observed a greater amount of pro-IL1β in human cells infected with RHΔROP18 than RH. Conclusions: ROP39-ROP5 and hGBP5-ROP5 interactions were confirmed by two different techniques. We model that ROP5 interacts with human GBP5 and this interaction could alter the activation of the NLRP3-inflamosome in human PBMCs in a ROP18-dependent manner.

RESUMEN Introducción: Toxoplasma secreta unas proteínas conocidas como ROP cinasas; (ROPs) las cuales son importantes para establecer la supervivencia y el crecimiento del parásito en el interior de la célula hospedera. Se ha evidenciado que el complejo ROP5/ROP18 secretado por Toxoplasma, es el mayor efector relacionado con virulencia en ratones; este complejo fosforila específicamente proteínas GTPasas inducidas por interferón (IRGs). No hay evidencia si este complejo u otras ROP cinasas están implicadas en el desarrollo de la toxoplasmosis humana. Objetivo: Evidenciar sustratos humanos para las proteínas cinasas ROP11, ROP39 ROP5 y ROP18 de Toxoplasma gondii en una línea celular humana. Metodología 1a: diseñamos un algoritmo llamado MSCA (Multiple Spectral Comparison Alignment) para la búsqueda de interacciones entre proteínas (Toxoplasma y Humano). 2a: las proteínas recombinantes ROP11, ROP39, y GBP5 se clonaron en pGEX4T1 y se expresaron en E. coli ROSSETTA DE3; con estas proteínas se realizaron ensayos de Pull-down Mass spectrometry (MS) y Pull-down Western blot (WB). 2b: utilizando el sistema de 2 híbridos en levadura (Y2H) realizamos ensayos de interacción proteína-proteína entre ROPs y GBPs humanas (Guanylate binding proteins). 2c: nosotros comparamos los niveles de pro-IL1β en PBMCs humanos infectados ex-vivo con Toxoplasma cepa RH o RHΔROP18. Resultados 1ª: MSCA propone las interacciones ROP11-SLC3A2, ROP11-ANXA6, ROP39-SHMT2, ROP39-ROP5, hGBP5-ROP5 y hGBP5-ROP18-. 2a: las interacciones ROP11-SLC3A2, ROP11-ANXA6, ROP39-SHMT2 y ROP39-ROP5 fueron confirmadas por Pull-down MS. 2b: observamos las interacciones hGBP5-ROP18 y hGBP5-ROP5- por Y2H. Se confirmaron las interacciones ROP39-ROP5 y ROP5-GBP5 por Pull-down-WB. 2c: Observamos mayor cantidad de pro-IL1β en PBMCs infectadas con RHΔROP18. Conclusiones: las interacciones ROP39-ROP5 y hGBP5-ROP5 fueron confirmadas por 2 técnicas diferentes. Sugerimos que ROP5 interacciona con GBP5 humana y esta interacción podría alterar la activación del inflamosoma dependiente de ROP18 en PBMCs humanos.