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dc.contributor.advisorUniversidad del Quindío - Colombia - Director - Jorge Enrique Gómez Marínspa
dc.contributor.authorCardona Pérez, Nestor Ivánspa
dc.date.accessioned2017-05-08T21:14:13Zspa
dc.date.available2017-05-08T21:14:13Zspa
dc.date.issued2015-05-30spa
dc.identifier.urihttps://bdigital.uniquindio.edu.co/handle/001/209spa
dc.description.abstractIt is known that CD8+ T cells are the subpopulation that plays an important role in the protective immunity against Toxoplasma gondii. The use of synthetic peptides from constitutive proteins or with an immunogenic potential as vaccine candidates are used to elicit a cytotoxic response. The immune response to peptides from proteins P30 and ROP18 of Toxoplasma in human lymphocytes with or without toxoplasmosis was analyzed. Population and proliferation of lymphocytes was determined by flow cytometry and levels of cytokines IL10 and IFN-γ in culture supernatant of lymphocytes was measured by ELISA. It was found that peptides from P30 and ROP18 are immunogenic and induce proliferation mainly on CD4+ over CD8+ and elicit production of IL10 over IFN-γ. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from HLA-A*02 individuals seropositive and seronegative for Toxoplasma were isolated to test if new peptides predicted by bioinformatics with high affinity for HLA-A*02 are recognized in the context of an infection by Toxoplasma. The immune response is lower when induced with P30 and ROP18 peptides than with GRA3 peptides. A new search for epitopes using bioinformatics tools allowed identifying a new set of peptides from which 4 (Got1, Ter1p, LMBR, PLA2) showed a good stimulation of IFN-γ in human HLA-A*02 PBMCs from Toxoplasma seropositive but not from seronegative individuals measured by ELISpot. A new rational methodology based on bioinformatics tools for Toxoplasma vaccine candidates is presented.eng
dc.description.abstractSe sabe que los linfocitos T CD8+ citotóxicos son la subpoblación que juega un papel importante en la inmunidad protectora contra Toxoplasma. El uso de péptidos sintéticos de proteínas constitutivas o con potencial inmunogénico como candidatos a vacuna contra Toxoplasma buscan estimular esta respuesta citotóxica. Se analizó la respuesta inmune en cultivos de linfocitos humanos con y sin toxoplasmosis a péptidos de las proteínas P30 y ROP18 de Toxoplasma. Se determinaron poblaciones y proliferación de linfocitos por citometría de flujo y se utilizó ELISA para determinar los niveles de IL10 e IFN-γ en sobrenadante de cultivo de linfocitos. Se encontró que los péptidos de P30 y ROP18 son inmunogénicos e inducen proliferación principalmente de CD4+ sobre CD8+ y estimulan la producción de IL10 sobre IFN-γ. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de individuos HLA-A*02 seronegativos y seropositivos para T. gondii para probar si nuevos péptidos con alta afinidad por HLA-A*02 predichos por bioinformática son reconocidos en el contexto de infección por Toxoplasma. La respuesta inducida por péptidos de P30 y ROP18 es menor cuando se compara con péptidos de GRA3. Posteriormente se realizó una nueva búsqueda de epítopes usando herramientas bioinformáticas lo que permitió identificar un nuevo set de péptidos de los cuales 4 (Got1, Ter1p, LMBR, PLA2) presentaron una buena estimulación de IFN-γ medida por ELISpot en células humanas de personas seropositivas para Toxoplasma y para HLA-A*02. Se presenta esta nueva estrategia racional de búsqueda de candidatos vacunales para Toxoplasma basada en el uso de herramientas bioinformáticas.spa
dc.description.tableofcontents1. INTRODUCCION GENERAL .................................................. 9 2. MARCO TEORICO ................................................................. 12 2.1 El parasito Toxoplasma gondii .............................................. 12 2.1.1 Taquizoítos, bradizoítos, quistes tisulares y ooquistes ...... 12 2.2 Ciclo de vida ......................................................................... 13 2.3 Estructura poblacional de Toxoplasma gondii ...................... 14 2.4 Respuesta inmune a la infección por Toxoplasma gondii ..... 16 2.4.1 Inmunidad innata, el papel de los TLRs ............................. 16 2.4.2 Mecanismos efectores mediados por IFN-γ ....................... 18 2.4.3 Inmunidad adaptativa ......................................................... 22 2.5 Procesamiento antigénico, memoria inmunología y haplotipos del complejo de histocompatibilidad tipo I. ....................................... 25 2.6 Vacunas basadas en péptidos contra Toxoplasma gondii ..... 30 2.7 Estrategias computacionales para la selección de epítopes inmunogénicos como candidatos a vacuna. ................................ 33 3. OBJETIVO ................................................................................ 36 4. METODOLOGIA ....................................................................... 36 4.1 Selección de muestras y aspectos bioéticos .......................... 36 4.2 Obtención de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y tipificación de HLA-A*02 ............................................................... 36 4.3 Preparación de antígeno total soluble de Toxoplasma (STAg) ..37 4.4 Respuesta de linfocitos a partir de sangre total. ....................... 38 4.5 Medición de citoquinas .............................................................. 38 4.6 Péptidos, lipopéptidos y adyuvantes ......................................... 39 4.6.1 Selección de péptidos para la fase 2 y la fase 3a del estudio. 40 4.6.2 Selección de péptidos para la fase 3b del estudio (pipeline)... 40 4.6.3 Modelamiento de las estructuras péptido/HLA ....................... 42 4.7 Ratones, inmunizaciones y reto con Toxoplasma ...................... 42 4.8 Ensayos de ELISpot ................................................................... 43 4.9 Análisis estadísticos ................................................................... 44 5. RESULTADOS .............................................................................. 45 5.1.1 Fase 1. Determinar si existe expansión de subpoblaciones de linfocitos CD4+ y CD8+ luego de estimularlos con péptidos derivados de la proteína SAG1-P30 (péptidos 2017vir y 2017avir) y péptidos derivados de la proteína ROP18 I, II y III. .......................................... 45 5.1.2 Determinar los niveles extracelulares de IFNγ e IL-10 en los sobrenadantes de los cultivos celulares de individuos con toxoplasmosis. ............................................................................................................ 46 5.2.1 Fase 2. Comparar ROP18 y SAG1 frente a péptidos de comprobada inmunogenicidad en humanos por ELISPOT (GRA3-GRA6) ............................................................................................................ 47 5.2.2 Bioensayo del péptido ROP18-I FQATGITYT en ratones transgénicos HLA-A*0201 Kb (pasantía Universidad de Chicago)............................................................................................. 49 5.3.1 Fase 3. Determinar la activación por medio de la medición de IFN-γ de subpoblaciones de linfocitos CD8+ cuando los péptidos se unen al HLA-A*02. ......................................................................................... 51 5.3.2 Selección de epítopes. ............................................................ 53 5.3.3 Evaluación de la producción de IFN-γ por ELISpot con los péptidos seleccionados por medio de la estrategia racional .......................... 56 6. DISCUSIÓN ................................................................................. 59spa
dc.format.mimetypeapplication/pdfspa
dc.language.isospaspa
dc.rightsDerechos Reservados - Universidad del Quindio, 2015spa
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by/4.0/spa
dc.subjectToxoplasma gondii, péptidos, candidatos vacunales, tubería bioinformáticaspa
dc.titleIdentificación de peptidos inmunogenicos de Toxoplasma gondii: Selección por ensayos ex vivo en muestras humanas HLA-A*02spa
dc.typeTrabajo de grado - Doctoradospa
dc.rights.accessrightsinfo:eu-repo/semantics/openAccessspa
dc.rights.creativecommonsAtribución 4.0 Internacional (CC BY 4.0)spa
dc.subject.lembToxoplasma gondii, péptidos, candidatos vacunales, tubería bioinformáticaspa
dc.type.coarhttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06spa
dc.type.driverinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisspa
dc.type.versioninfo:eu-repo/semantics/draftspa
dc.description.degreelevelDoctoradospa
dc.description.degreenameDoctor en Ciencias Biomédicasspa
dc.publisher.facultyCiencias de la Salud - Doctorado en Ciencias Biomedicasspa
dc.type.contentTextspa
dc.type.redcolhttps://purl.org/redcol/resource_type/TDspa
oaire.accessrightshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2spa
oaire.versionhttp://purl.org/coar/version/c_b1a7d7d4d402bccespa


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